Rekombinante Fsh- und Lh-Therapie zur Laichinduktion von prävitellogen und früh spermatogen arretierten Knochenfischen, der Flachkopf-Meeräsche (Mugil cephalus)

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 6563 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mit der Ausweitung und Diversifizierung der globalen Aquakultur werden weiterhin Anstrengungen unternommen, neue Biotechnologien für die unterstützte Reproduktion bei Arten zu entwickeln, die Fortpflanzungsstörungen aufweisen. Männchen der Flachkopf-Meeräsche (Mugil cephalus), die im Mittelmeerraum unter intensiven Bedingungen gehalten werden, produzieren keine fließende Milch und die meisten Weibchen werden bei der Prävitellogenese gestoppt. Die wöchentlichen Injektionen von rekombinantem follikelstimulierendem Hormon (rFsh) und luteinisierendem Hormon (rLh) induzierten und vervollständigten die Vitellogenese bei behandelten Frauen (n = 21), und behandelte Männer produzierten fließendes Sperma (n = 9). Die Anwendung einer Priming-Dosis von 30 µg kg-1 rLh und einer Auflösungsdosis von 40 mg kg-1 Progesteron oder einer Priming- und Auflösungsdosis von 30 µg kg-1 rLh führte zur Induktion von Reifung, Ovulation und spontanem Laichen ein Laicherfolg von 85 % (8 von 9 Weibchen) bzw. 100 % (n = 6). Die gesammelten Eier hatten eine Befruchtung von 63 ± 21 % mit Embryoentwicklung und eine Schlüpfrate von 58 ± 23 %. Im Vergleich dazu zeigten die Kontrollpersonen keine Fortschritte in der Gonadenentwicklung und produzierten keine flüssigen Spermien. Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen die Möglichkeit, die Oogenese von der Prävitellogenese bis zum Abschluss der Reifung und dem Laichen im gedüngten Becken unter ausschließlicher Verwendung von rFsh und rLh bei einer Knochenfischart zu kontrollieren.

Die intensive Aquakultur sucht nach Möglichkeiten zur Verbesserung der Fortpflanzungskontrolle, insbesondere bei Arten mit Fortpflanzungsstörungen, um die Versorgung mit Jungfischen für die kommerzielle Großproduktion sicherzustellen. Die Entwicklung von Kulturprotokollen wird nicht nur eine konsistente und nachhaltige Versorgung für Zuchtbetriebe gewährleisten, sondern auch genetische Verbesserungen durch selektive Züchtung ermöglichen. Der Erfolg von Kulturprotokollen wird wiederum den fischereilichen Druck auf Bestände natürlicher Populationen verringern, die in vielen Fällen gefährdet sind. Ein wesentlicher Bestandteil für eine zuverlässige Versorgung mit Jungfischen ist die Kontrolle der Fortpflanzung erwachsener Fische in Gefangenschaft. Allerdings kommt es bei einigen Arten in Gefangenschaft nicht zu einer vollständigen Fortpflanzung, und zur Entwicklung der Aquakulturproduktion wurden exogene Hormontherapien eingesetzt.

Die beiden Fortpflanzungsstadien Gametogenese (Oogenese und Spermatogenese) und Reifung (Oozytenreifung und Spermiation) werden durch verschiedene Fortpflanzungshormone gesteuert, die in der Hypophyse und den Gonaden produziert werden, nämlich Gonadotropinhormone (Gths) und Steroide1. Hormontherapien, die auf Gonadotropin-Releasing-Hormonen und luteinisierenden Hormonrezeptoragonisten (humane Choriongonadotropine oder Hypophysenextrakte) basieren, werden häufig zur Kontrolle der Reifungsphase eingesetzt, während die hormonelle Kontrolle der Gametogenese in der Aquakulturindustrie selten eingesetzt wird2. Der Einsatz relativ neuer rekombinanter Gonadotropinhormone (rGths), der rekombinanten follikelstimulierenden (rFsh) und luteinisierenden Hormone (rLh) kann in der Aquakultur neue Strategien zur Behandlung von Reproduktionsstörungen und zur Entwicklung von Zuchtprogrammen außerhalb der Saison eröffnen3. Zu diesem Zweck wurden verschiedene In-vivo-Behandlungen entwickelt, die sich hauptsächlich auf die Endreifungs- und Spermiations-/Ovulationsstadien durch einfache oder doppelte rGths-Injektionen konzentrieren4,5. Fischarten, die in den frühen Stadien des Fortpflanzungszyklus angehalten werden, erfordern jedoch eine Kontrolle der Gametogenese mit Langzeitbehandlungen mit wiederholten Injektionen, die erhöhte Plasmaspiegel von spezifischem Gths3 aufrechterhalten. Im Falle von Männchen wurden unterschiedliche erfolgreiche Langzeitansätze für unreifen europäischen Aal (Anguilla anguilla)6 und reife senegalesische Seezunge (Solea senegalensis)7,8 beschrieben. Im Fall von Weibchen war es schwierig, ähnliche Langzeitbehandlungen zu definieren, um lebensfähige Gameten von Weibchen zu produzieren, die vor der Vitellogenese arretiert wurden. Ein erheblicher Fortschritt wurde mit der Langzeitbehandlung prävitellogener Meeräschenweibchen (Mugil cephalus) mit rFsh und rLh erzielt, um die Vitellogenese erfolgreich abzuschließen9. Nach der Reifungsinduktion mit rLh und Progesteron (P4) gelang es den Weibchen, die mit spermiierenden Männchen gehalten wurden, jedoch nicht, spontan zu laichen. Daher wurden Gameten entfernt und künstlich befruchtet und es wurde ein geringer Prozentsatz an Befruchtung (< 1 %) erzielt, was die Durchführbarkeit des Verfahrens für Aquakulturzwecke in Frage stellte. Trotz der geringen Befruchtung zeigte die Studie jedoch die Möglichkeit der Verwendung von rFsh und rLh, um die Oogenese ausgehend von der Prävitellogenese zu induzieren, um unter intensiven Bedingungen Eier und Larven zu erhalten, und regte weitere Forschung zur Verbesserung der erzielten Ergebnisse an.

Die Flachkopf-Meeräsche ist weltweit in tropischen, subtropischen und gemäßigten Gewässern verbreitet10, toleriert unterschiedliche Salzgehalte, verfügt über eine ausgezeichnete Fleischqualität und hohe Wachstumsraten. Es handelt sich um eine wichtige Art und einen potenziellen Kandidaten für die Diversifizierung von Aquakulturprodukten, vor allem im Mittelmeerraum, Südostasien, Taiwan, Japan und Hawaii11. Im Mittelmeerraum laichen die Flachkopf-Meeräschen von Juli bis Oktober12. Bei Züchtern, die unter intensiven Bedingungen gehalten werden, kommt es jedoch zu Fortpflanzungsstörungen; Männchen produzieren selten flüssige Milch13,14,15 und Weibchen kommen bei der Prävitellogenese9 oder frühen Stadien der Vitellogenese15 zum Stillstand.

Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, zu zeigen, dass eine Langzeitbehandlung mit rGths, rFsh und rLh die Gametogenese bei Männchen von Flachkopf-Meeräschen ohne fließende Spermiation und bei Weibchen, die in frühen Stadien der Gametogenese angehalten werden, um das Laichen von Eiern mit guten Befruchtungsraten zu erreichen, induzieren kann die lebensfähige Larven liefern. Verschiedene auf rLh und P4 basierende Behandlungen wurden getestet, um die Reifung und das Laichen der Eizellen bei Weibchen zu induzieren. Um die Entwicklung und das Wachstum der Larven zu überprüfen, wurde abschließend mit den gewonnenen Eiern ein Vorversuch zur Larvenaufzucht im Mesokosmenverfahren durchgeführt.

Die Studie wurde im Einklang mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU vom 22. September zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt; das spanische Königliche Dekret 53/2013 vom 1. Februar über den Schutz von Tieren, die für Experimente oder andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden; das katalanische Gesetz 5/1995 vom 21. Juni zum Schutz von Tieren, die für Versuche oder andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, und das katalanische Dekret 214/1997 vom 30. Juli zur Regelung der Verwendung von Tieren für Versuche oder andere wissenschaftliche Zwecke. Die verwendeten Verfahren wurden vom Komitee für Ethik und Tierversuche (CEEA) des IRTA (Institut für Agrarlebensmittelforschung und -technologie) und der katalanischen Regierung bewertet und mit der ID V7MH4802M genehmigt. Die Autoren hielten sich an die ARRIVE-Richtlinien.

Ein Flachkopf-Meeräschen-Brutbestand wurde aus Individuen gebildet, die ursprünglich aus dem Fluss Ebro (Spanien) oder aus einer semi-extensiven Teichfischfarm (Finca Veta La Palma, Isla Mayor, Spanien) stammten und 1,5 bis 3,5 Jahre lang in IRTA-Einrichtungen gehalten wurden (Sant Carles de la Ràpita, Spanien). Es wurden 30 Weibchen mit einem Gewicht von 0,9 bis 2,2 kg und einer Standardlänge (SL) von 37 bis 53 cm sowie 15 Männchen mit einem Gewicht von 0,7 bis 1,3 kg und einer SL von 34 bis 43,5 cm verwendet. Alle Fische waren größer als die angegebene SL für die erste Reifung dieser Art (27–35 cm für Weibchen, 25–30 cm für Männchen)12. Zur Identifizierung von Individuen wurde jeder Fisch intramuskulär mit einem Passive Integrated Transponder (PIT)-Tag (Trovan®, ZEUS Euroinversiones SL Madrid, Spanien) markiert. Das Geschlecht der Individuen wurde durch das Vorhandensein oder Fehlen von Eizellen bestimmt, die durch leichtes Absaugen mit einem 1,67-mm-Kunststoffkatheter, der durch die Genitalöffnung eingeführt wurde, gewonnen wurden. Die Fische wurden im letzten Jahr in abgedeckten 10-m3-Tanks in einem Kreislaufsystem (IRTAmar®) gehalten, das mit 36‰ Salzgehaltwasser unter natürlichen Lichtbedingungen und kontrollierten Wintertemperaturen (≥ 14 °C) versorgt wurde. Vor der Studie, die von Anfang August bis Anfang November durchgeführt wurde, wurde der ausgewählte Brutbestand in einen anderen 10-m3-Tank überführt, die Wassertemperatur wurde auf 23,1 ± 0,2 °C kontrolliert und die Photoperiode war Umgebungstemperatur (14L:10D–11L:13D). Die Fische wurden sieben Tage die Woche mit 1,5 % ihres Körpergewichts mit einer Mischung aus zwei kommerziellen Meeresfischfuttermitteln gefüttert; 90 % Mischung aus Le-2 und Le-5 Europa RG (Skretting, Spanien) und 10 % Brood Feed Lean (Sparos, Portugal). Während aller experimentellen Verfahren, zur Hormonverabreichung und Probenahme, wurden die Fische mit 73 mg L−1 MS-222 anästhesiert. Wenn es für die Studie erforderlich war, wurden die Männchen mit einer Überdosis MS-222 (250 mg L−1) eingeschläfert und der Tod durch einen Schnitt in die Kiemen bestätigt, um die Fische auszubluten.

Die Weibchen wurden nach dem Zufallsprinzip den rGth- und Kontrollgruppen zugeteilt, wobei darauf geachtet wurde, dass in beiden Gruppen eine ähnliche Verteilung der Weibchen in unterschiedlichen anfänglichen Reifestadien herrschte. Die Kontrollgruppe (insgesamt n = 9) bestand aus 6 Weibchen in der Prävitellogenese (5 im Primärwachstum und 1 im Stadium der kortikalen Alveolen) und 3 in der frühen Vitellogenese. Insgesamt 21 Frauen wurden der Hormonbehandlung zugeteilt; 12 Weibchen befanden sich zunächst in der Prävitellogenese (8 im Primärwachstum und 4 im kortikalen Alveolenstadium) und 9 in der frühen Vitellogenese. Die Weibchen in der frühen Vitellogenese verbrachten längere Zeit in intensiver Gefangenschaft (> 2,25 Jahre), obwohl nicht alle Weibchen, die für diesen Zeitraum festgehalten wurden, mit der Vitellogenese begonnen hatten.

Einzelkettige rekombinante Mugil cephalus rFsh und rLh, hergestellt in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), wurden von Rara Avis Biotec SL (Valencia, Spanien) erworben. Mugil cephalus rFsh wurde mit einer Konzentration von 12 μg mL-1 und rLh mit einer Konzentration von 8 μg mL-1 geliefert. Es wurde eine Methodik befolgt, die auf dem von Ramos-Júdez et al.9 beschriebenen Protokoll basiert. Das Anwendungsmuster von rFsh und rLh zielte darauf ab, die physiologischen Variationen von Fsh und Lh im Zusammenhang mit der natürlichen Fortpflanzungsentwicklung nachzuahmen; Zunächst wurde in den frühen Stadien der Gametogenese nur rFsh verabreicht, und anschließend kam es zu einer Abnahme von rFsh mit einem Anstieg von rLh, um die späte Gametogenese zu regulieren16. Das Protokoll wurde entsprechend der Eierstockentwicklung angewendet (Abb. 1). Ansteigende wöchentliche Dosen von 6, 9 und 12 µg kg−1 rFsh wurden intramuskulär verabreicht, um die Prävitellogenese (~ 100 µm Eizellendurchmesser) bis zur Vitellogenese (> 200 µm) zu induzieren. Die wöchentlichen Dosen wurden während der Vitellogenese bei 12 µg kg-1 gehalten. Mit fortschreitender Vitellogenese und wenn der mittlere Durchmesser der am weitesten entwickelten Eizellen ≥ 300 µm betrug, erhielten die Weibchen zusätzlich eine wöchentliche Verabreichung von rLh in steigenden Dosen. Anfänglich wurde eine rLh-Dosis von 2,5 µg kg-1 verabreicht und beibehalten, bis die Weibchen in die späte Vitellogenese eintraten (≥ 400 µm)17 und dann auf 4 und 6 µg kg-1 erhöht. Bei einem Oozytendurchmesser von ~ 500 µm wurden die wöchentlichen rFsh-Dosen auf 4 µg kg−1 reduziert, während rLh auf 9 µg kg−1 erhöht wurde. Eine Kombination aus 4 μg kg-1 rFsh und 12 μg kg-1 rLh pro Woche wurde verabreicht, bis das vitellogene Wachstum abgeschlossen war. Der Abschluss des Eizellenwachstums wurde festgestellt, wenn davon ausgegangen wurde, dass sich die Eizellen der Reifung näherten; Die mikroskopische Untersuchung ergab, dass die am weitesten entwickelten Eizellen einen Durchmesser von nahezu 600 µm hatten. Die neun Weibchen in der Kontrollgruppe wurden ebenfalls jede Woche manipuliert und erhielten insgesamt zwölf Mal Injektionen mit Kochsalzlösung (1 ml).

Schematische Darstellung der rFsh- und rLh-Behandlung bei Flachkopf-Meeräschenweibchen (n = 21). Das Protokoll wurde entsprechend der durch Eierstockbiopsien ermittelten Entwicklung der weiblichen Keimdrüsen angewendet. Wöchentliche Dosen von 6, 9 und 12 µg kg−1 rFsh wurden angewendet, um die Prävitellogenese (~ 100 µm Eizellendurchmesser) bis zur Vitellogenese (> 200 µm) zu induzieren, und das vitellogene Wachstum wurde mit einer Dosis von 12 µg kg−1 pro Woche aufrechterhalten. Wenn der mittlere Durchmesser der größten Eizellen ≥ 300 µm betrug, wurde zusätzlich zu rFsh rLh in steigenden Dosen verabreicht. Anfänglich wurde eine rLh-Dosis von 2,5 µg kg-1 verabreicht und beibehalten, bis die Weibchen Eizellen mit einer Größe von ≥ 400 µm präsentierten. Anschließend wurde die Dosis auf 4 und 6 µg kg-1 erhöht. Bei einem Durchmesser von ca. 500 µm wurden die wöchentlichen rFsh-Dosen auf 4 μg kg−1 reduziert, während rLh auf 9 μg kg−1 erhöht wurde. Eine Kombination aus 4 μg kg-1 rFsh und 12 μg kg-1 rLh pro Woche wurde verabreicht, bis das vitellogene Wachstum abgeschlossen war (~ 600 μm). Jeder Punkt entspricht einer wöchentlichen Verabreichung. Dieses Schema stellt das längste Verabreichungsmuster bei den Weibchen dar, bei denen insgesamt dreizehn Wochen erforderlich waren, um das vitellogene Wachstum abzuschließen.

Die Beurteilung der Gonadenentwicklung erfolgte alle zwei Wochen durch Ovarialbiopsien, die durch leichtes Absaugen durch eine Kunststoffkanüle entnommen wurden. Frische Eierstockproben wurden unter einem Mikroskop (40-fache Vergrößerung) untersucht, um den mittleren Durchmesser der am weitesten fortgeschrittenen Eizellen (n = 20 pro Frau) zu messen, und eine Probe wurde für die Histologie fixiert. Blutproben wurden vor der ersten Behandlung (Woche 0) und nach Abschluss des vitellogenen Wachstums in der behandelten Gruppe und am Ende des Experiments in der Kontrollgruppe entnommen.

Parallel dazu wurden die Männchen nach dem Zufallsprinzip den rGth- und Kontrollgruppen zugeteilt, wobei darauf geachtet wurde, dass in beiden Gruppen eine ähnliche Verteilung der Männchen in unterschiedlichen anfänglichen Reifestadien herrschte. Die Kontrollgruppe (insgesamt n = 6) bestand aus 5 Männern ohne Spermien und 1 mit Spermien (Spermienindex 1, Spermien vorhanden, aber keine Flüssigkeit, siehe unten). Insgesamt 9 Männer erhielten die Hormonbehandlung; 7 Männer ohne Spermien und 2 mit Spermien (Spermienindex 1). Mit rGth behandelte Männer wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, die die gleiche Behandlung erhielten, jedoch zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Versuchszeitraum. Der Grund bestand darin, die Verfügbarkeit von spermiierenden Männchen für die Laichinduktion sicherzustellen, wenn die Weibchen das vitellogene Wachstum abgeschlossen hatten. Gruppe 1 der Männer (n = 4 Behandelte, n = 3 Kontrolle) begann die Behandlung in Woche 1 und Gruppe 2 (n = 5 Behandelte, n = 3 Kontrolle) in Woche 3 (Abb. 2). Ziel der Behandlung war es, rGths entsprechend ihrer beschriebenen Rolle bei der Spermatogenese einzusetzen. Steigende Dosen von rFsh (6, 9 und 12 µg kg−1) wurden in der frühen Spermatogenese und hohe Dosen (12 µg kg−1) während des Hodenwachstums verabreicht (Abb. 3). Während der frühen Spermatogenese wurde kein rLh verabreicht, sowohl rFsh als auch rLh (12 µg kg-1 von rFsh und rLh) während der mittleren Stadien des Hodenwachstums und nur rLh (12 µg kg-1) wurde in späten Stadien verabreicht, um die Spermienreifung zu induzieren18 . Gruppe 1 erhielt die Behandlung insgesamt 12 Wochen lang, Gruppe 2 10 Wochen lang. In Woche 9 erhielt Gruppe 1 eine Dosis von 12 µg kg−1 rFsh anstelle von rLh, da eine Verringerung des Spermiationsstadiums beobachtet wurde (siehe Abschnitt „Induktion der Spermatogenese und Spermiation“). Die Dosen lagen im Bereich früherer Studien mit Männern, bei denen in CHO-Zellen produzierte rGths verwendet wurden6,7,8,9. Kontrollmännchen wurde wöchentlich 1 ml Kochsalzlösung injiziert.

Gesamtschema des Experiments. Weibchen, die die rGths-Behandlung erhielten, erhielten wöchentlich Injektionen bis zum Abschluss des vitellogenen Wachstums, das nach 13 Verabreichungen innerhalb eines Zeitraums von maximal 13 Wochen stattfand. Die Pfeilspitzen zeigen den Moment an, in dem einzelne Weibchen zum Laichen veranlasst wurden (die Anzahl der Weibchen wird durch die Zahl oben angezeigt). Kontrollweibchen erhielten insgesamt 12 Kochsalzinjektionen. Gruppe 1 der Männer begann die Behandlungen (rGth-Behandlung und Kochsalzlösung) in Woche 1, während Gruppe 2 in Woche 3 begann.

Diagramm der hormonellen Behandlung von Flachkopf-Meeräschen-Männchen. Das Sternchen gibt den Zeitpunkt an, an dem Gruppe 1 12 µg kg−1 rFsh anstelle von rLh erhielt. Grün zeigt die Verabreichung von rFsh an und Blau zeigt die Verabreichung von rLh an.

Um das Fortschreiten der Reifung zu beurteilen, wurde zu Beginn der Behandlung und wöchentlich ein sanfter Druck auf den Bauchraum in Richtung der Urogenitalöffnung ausgeübt, um die Spermien freizusetzen. Das Spermiationsstadium wurde auf einer Skala von 0 bis 3 bestimmt (0 = nicht fließend, 1 = fließend, aber es kann keine Probe entnommen werden, 2 = fließend, 3 = sehr fließend). Bei dieser Methode werden nur reife Zellen zusammen mit dem Samenplasma freigesetzt. Um das Entwicklungsstadium bei Männern zu bestimmen, wurden daher einige Männer zu Beginn (n = 2) und am Ende der Behandlung (n = 2 pro Gruppe) getötet und die Hoden für histologische Untersuchungen und die Messung des gonadosomatischen Index entfernt ( GSI: Hodengewicht/Fischgewicht × 100). Gegen Ende des Experiments (Woche 10 und 13) wurden Spermienproben laufender Männchen entnommen, das Gesamtvolumen aufgezeichnet und zur Analyse der Spermienqualität bei 4 °C gelagert. Außerdem wurden alle zwei Behandlungswochen Blutproben von den behandelten und den Kontrollmännchen entnommen.

Für die Reifung und Laichinduktion wurden drei verschiedene Behandlungen angewendet. Weibchen, die das vitellogene Wachstum abgeschlossen hatten (bestimmt durch Gonadenbiopsie), und Männchen mit laufender Milch (Spermiationsstadium 2 oder 3) wurden für die Laichinduktion ausgewählt. Die Individuen wurden von der Hauptgruppe getrennt und pro Behandlung in einem separaten 10-m3-Tank gehalten. Die drei separaten Tanks hatten die gleichen Bedingungen wie der Vorratstank. Ein Männchen in jedem Laichbecken erhielt eine Dosis von 24 µg kg-1 rLh, während die anderen der zuvor beschriebenen Hormonbehandlung folgten und 12 µg kg-1 rLh erhielten. Den ausgewählten Weibchen wurde intramuskulär entweder (i) rLh zur Vorbereitung und Auflösung von Progesteron (P4) (Prolutex, IBSA Group, Italien) wie bei Ramos-Júdez et al.9, (ii) rLh zur Vorbereitung und Auflösung von Injektionen oder (iii) P4 injiziert zur Vorbereitung und Auflösung von Injektionen (Dosen in Tabelle 1). Priming- und Resolving-Injektionen wurden im Abstand von 24:05 ± 0:40 h verabreicht. Mit einer Kanüle wurden Eierstockproben entnommen und vor jeder Verabreichung untersucht. Die Reifung und die Ovulationsinduktion der Weibchen aus jeder Behandlungsgruppe wurden an verschiedenen aufeinanderfolgenden Tagen gestaffelt, um die verschiedenen Laichereignisse zu trennen. Das Geschlechterverhältnis betrug je nach Verfügbarkeit der Männchen 1:2 oder 1:3 (Weibchen:Männchen) pro Laichvorgang. Nach allen Laichereignissen wurden die Männchen mit der Hauptgruppe in das ursprüngliche Becken zurückgebracht. In den Fällen, in denen die Weibchen einen Eisprung hatten und einen geschwollenen Bauch zeigten, die Eier aber nicht freisetzten, wurde eine manuelle Entnahme durchgeführt.

Parallel dazu wurden Eizellen, die durch Kanülierung von Weibchen (n = 6) gewonnen wurden, die die Priming-Injektion von rLh (30 µg kg−1) erhalten hatten, in vitro mit verschiedenen Hormonen inkubiert. Insgesamt 58,7 ± 29,9 Eizellen wurden in einer Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 200 µL Leibovitz L-15-Medium inkubiert, entweder ohne Hormon (Kontrolle) oder mit rLh (Konzentrationen von 400, 200, 100, 50 und 10 ng). mL−1), rFsh (400, 200, 100, 50 und 10 ng mL−1) oder P4 (4000, 1000, 500 und 50 ng mL−1). Jede Behandlung wurde dreifach auf die Eizellen jeder Frau angewendet. Nach 48-stündiger Inkubation bei 21 °C wurden die Follikel unter einem Binokularmikroskop untersucht und in jeder Vertiefung Eizellen ohne Follikelschicht (ovuliert) und intakte Follikel (nicht ovuliert) gezählt.

Eiersammler mit Oberflächenabfluss (Maschenweite 500 μm) wurden zur Aufnahme von Eiern aus den Tanks platziert und regelmäßig auf Eier untersucht. Sobald das Laichen beobachtet wurde, wurden die Eier in einen 10-l-Eimer überführt. Die Anzahl der Eier pro Laich (Fruchtbarkeit) wurde durch Zählen der Eier in dreifachen Teilproben geschätzt. Eine Probe von Eiern (n = 50–100) wurde unter einem Mikroskop beobachtet und der Prozentsatz (%) der Befruchtung für jede Charge gelaichter Eier wurde durch Berechnen des Prozentsatzes der Eier bestimmt, die das 2- bis 16-Zellen-Stadium erreichten. Die Bruteier wurden nach sorgfältigem Rühren der Eier im 10-l-Eimer gesammelt. Die Eier wurden mit einer Dichte von 13.230 ± 7273 Eiern pro Liter in 30-Liter-Inkubatoren unter den gleichen Bedingungen wie in den Bruttanks inkubiert. Jeder Brutkasten war mit einem Luftstein in der Mitte ausgestattet, um die Eier in der Schwebe zu halten und eine Ansammlung der Eier an der Oberfläche oder dem Boden des Brutkastens zu verhindern. Die Anzahl der Eier in jedem Inkubator wurde geschätzt, indem der Inkubator homogen gemischt und drei 100-ml-Proben entnommen und die Eier in jeder Probe gezählt wurden. Man ließ den Eiern einen Tag Zeit, sich zu entwickeln, und die Überlebensrate (Prozentsatz der Eier mit Embryonen) wurde anhand einer prozentualen Befruchtung anhand einer aus dem Inkubator entnommenen Eiprobe (n = 50–100) geschätzt. Am folgenden Tag wurde die Anzahl der geschlüpften Larven in jedem Inkubator volumetrisch wie bei den Eiern geschätzt. Parallel zu den 30-l-Inkubatoren wurden befruchtete Eier in einzelne, mit sterilem Meerwasser gefüllte Vertiefungen in einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen (EIA-Platte) überführt und für jeden Laich in zweifacher Ausfertigung in einen gekühlten Inkubator bei 21 °C gestellt und täglich überprüft Die letzte Larve starb, um die Schlupfrate und das Überleben der Larven unter Hunger abzuschätzen, wie bei Giménez et al.19. Der Prozentsatz des Überlebens wurde als Anzahl der lebenden Larven/Gesamtzahl der geschlüpften Larven berechnet.

Es wurde ein Vorversuch durchgeführt, um das Wachstum und die Entwicklung der Larven zu untersuchen. Der Versuch konzentrierte sich nicht auf das Überleben, da die Einrichtungen und das Personal nicht zur Verfügung standen, um den Larven optimale Bedingungen zu bieten. Die Larvenaufzucht erfolgte unter Mesokosmenbedingungen20, mit geringer Larvendichte in einem großen Tank (6 Larven pro Liter, 1500-l-Tank), unter natürlicheren oder zumindest weniger strengen Bedingungen als bei der Intensivaufzucht und unter Verwendung einer endogenen Blüte wilden marinen Zooplanktons, hauptsächlich Harpacticoid-Copepoden, zusammen mit der periodischen Hinzufügung von Rädertierchen und Artemia-Nauplien. Der Versuch wurde vom 11. November bis 18. Dezember 2020 mit Larven 4 Tage nach dem Schlüpfen (dph) durchgeführt, die am 7. November aus einem mit der rLh + rLh-Laichbehandlung gewonnenen Laich geschlüpft waren. Die Larven wurden in einem 1500-l-Tank bei 20 °C und einer Photoperiode von 12 hL:12 hD gelagert und 26 Tage lang mit Rädertierchen gefüttert (4 bis 30 dph), gefolgt von frisch geschlüpften A. nauplii (24–39 dph). Phytoplankton (eine Mischung aus Tetraselmis suecica und Isochrysis galbana) wurde jeden Tag hinzugefügt, um ein grünes Medium aufrechtzuerhalten, und alle zwei Tage wurde die Rädertierkonzentration bestimmt, um eine Dichte von 5 mL-1 Fäulnis aufrechtzuerhalten. Artemia-Nauplien wurden hinzugefügt, als die Larven 4,3 mm TL (20 dph) erreichten, was nach 5 mm TL die Hauptnahrung für die Larven darstellte, wie von Hagiwara et al.21 vorgeschlagen.

Zehn willkürlich ausgewählte Larven wurden bei 4, 6, 9, 11, 17, 23, 27, 32, 37 und 39 dph beprobt und mit MS-222 betäubt. Die Standardlänge wurde mit einer Digitalkamera gemessen, die an einen Bildanalysator (AnalySIS, SIS Gmbh, Deutschland) angeschlossen war. Fotos wurden auch verwendet, um das Vorhandensein oder Fehlen von Nahrung im Darm abzuschätzen und das Aufblasen der Schwimmblase sowie andere Indikatoren der Larvenentwicklung zu untersuchen.

Durch Kanülierung gewonnene Eierstockproben und Hodenteile wurden 24 Stunden lang in Bouin-Flüssigkeit konserviert und bis zur Verarbeitung in 70 % Ethanol gelagert. Die dehydrierten Gewebe wurden in Paraffin eingebettet und 3 μm-Schnitte geschnitten. Die Hodenabschnitte (vom vorderen, mittleren und hinteren Teil) wurden ausgerichtet, um horizontale Schnitte zu erhalten. Schnittschnitte wurden zur morphologischen Beurteilung mit Hämatoxylin und Eosin (Casa Álvarez, Spanien) gefärbt. Die Objektträger wurden unter einem Lichtmikroskop (Leica DMLB, Houston, USA) untersucht.

Eizellen wurden wie zuvor von Ramos-Júdez et al.9 beschrieben klassifiziert. Eizellen wurden als prävitellogen klassifiziert: mit primär wachsenden (PG) Eizellen, die mehrere Nukleolen im Keimbläschen aufwiesen, oder mit kortikalen Alveolen (SGca) Eizellen, die kleine Öltröpfchen und körnige Vesikel im peripheren Ooplasma aufwiesen. Der Einbau von Dotterkügelchen deutete auf vitellogene Stadien hin: frühes sekundäres Wachstum (SGe), spätsekundäres Wachstum (SGl), wenn die Eizellen ≥ 400 μm17 erreichten, und ausgewachsene sekundäre Wachstumsoozyten (SGfg), wenn das vitellogene Wachstum mit der Fusion des Eigelbs abgeschlossen war Granulat und Verdickung der Vitellinmembran. Eizellen wurden als Eizellenreifungsstadium (OM) klassifiziert, wenn Öltröpfchen zusammenflossen und sich der Kern auf einer Seite der Eizelle befand, was den Beginn der Keimbläschenmigration (GVM) anzeigte. Eizellen mit zerfallender Struktur und Hypertrophie wiesen eine Atresie auf22. Das Reifestadium der Weibchen wurde anhand des am weitesten entwickelten Stadiums der vorhandenen Eizellen bestimmt. Darüber hinaus wurde der Prozentsatz der Eizellen in verschiedenen Stadien in den Eierstöcken über die Wochen hinweg berechnet, indem jede Woche ≥ 50 zufällige Eizellen pro Frau identifiziert wurden.

Um Hodenproben zu bewerten, wurde die Anzahl der Spermatogonien Typ A und B (SPG), Spermatozyten (SPC), Spermatiden (SPD) und Spermatozoen (SPZ) in 12 Samenkanälchen, die zufällig aus verschiedenen Bereichen (vorderer, mittlerer und hinterer) ausgewählt wurden, bewertet Probe und die prozentuale Häufigkeit jedes Keimzelltyps wurde bestimmt.

Zur Qualitätsbewertung wurden in Woche 10 und Woche 13 am Ende des Versuchszeitraums Spermienproben laufender Männchen entnommen. Die Proben wurden in einer 1-ml-Spritze gesammelt, um eine Kontamination durch Urin, Fäkalien und Wasser zu vermeiden. Das Sperma wurde in zwei Aliquots aufgeteilt, eines wurde als unverdünntes Sperma aufbewahrt und eines wurde 1:10 (1 Teil Sperma + 9 Teile Verdünnungsmittel) in Marine Freeze® (IMV Technologies, L'Aigle, Frankreich) als Streckmittel23 verdünnt und beide Proben wurden darin aufbewahrt Eppendorf-Röhrchen bei 4 °C bis zur Auswertung. Die Aktivierung der Spermien erfolgte durch Pipettieren von 5 µL der Spermienprobe (unverdünnt oder verdünnt) in einen Eppendorf mit je nach Spermienkonzentration 195, 295, 495 oder 995 µL Meerwasser. Sofort wurde das Eppendorf gerührt, um es gründlich zu vermischen, dann wurden 2 μl aktiviertes Sperma in eine ISAS-Zählkammer (Integrated Sperm Analysis System, Spanien) pipettiert, und 15 Sekunden nach der Aktivierung mit dem CASA-System wurden Videos von Spuren der aktivierten Spermatozoen aufgezeichnet SCA-VET-01 (Microptic, Barcelona, ​​Spanien). Die Videos wurden mit einer Digitalkamera (Basler Ace ACA1300-200UC, Basler AG, Ahrensburg, Deutschland) aufgenommen, die an ein optisches Phasenkontrastmikroskop (Nikon Eclipse Ci, Tokio, Japan) mit einem 10-fach negativen Phasenkontrastobjektiv angeschlossen war. Die folgenden Spermienparameter wurden bestimmt: (1) Spermienkonzentration (spz mL−1), (2) Spermienmotilität (%), (3) schnell fortschreitende Spermien (%) und (4) Spermiengeschwindigkeit (μm s−1) : die krummlinige Geschwindigkeit (VCL), die geradlinige Geschwindigkeit (VSL) und die durchschnittliche Pfadgeschwindigkeit (VAP). Das CASA-Programm war darauf ausgelegt, bewegliche Spermien mit einer VCL von > 25 μm s−1 und schnell fortschreitende Spermien mit einer Geradheit (SRT = VSL/VAP × 100) von > 80 % und einer VCL von > 80 μm s−1 zu klassifizieren 1. Alle Proben wurden am Tag der Entnahme und 48 Stunden nach der Entnahme analysiert. Am Ende des Experiments (Woche 13) gesammelte Proben wurden auch an den Tagen 1, 4, 6, 8, 11, 13 und 15 nach der Entnahme analysiert.

Blutproben wurden gesammelt und 15 Minuten lang bei 4 ° C mit 3000 U / min zentrifugiert und das Plasma bis zur Analyse bei –80 ° C gelagert. Die Plasmaspiegel von 17β-Östradiol (E2) und 11-Ketotestosteron (11-KT) wurden mithilfe kommerziell erhältlicher Enzymimmunoassays (EIA) (Cayman Chemical Company, USA) analysiert. Steroide wurden mit verdampftem Methanol extrahiert und die Extrakte wurden 1:10 (E2) oder 1:100 (11-KT) im EIA-Puffer resuspendiert.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Ein Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um die Verteilung zwischen Gruppen von Fischen zu untersuchen, die zu Beginn des Experiments unterschiedliche Reifestadien hatten, und um zu untersuchen, ob Fische, die Eisprung oder Laichen hatten, zu Beginn des Experiments einen bestimmten Reifestatus hatten. Shapiro-Wilk- und Levene-Tests wurden verwendet, um die Normalität der Datenverteilung bzw. die Homogenität der Varianz zu überprüfen. Der Mann-Whitney-U-Test oder der Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunns paarweisem Vergleich, wurden in nicht normalverteilten Daten verwendet, um den Eizellendurchmesser zwischen der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe innerhalb einer Woche bzw. zwischen Wochen während des Experiments zu vergleichen. Eine Einweg-ANOVA mit anschließendem Holm-Sidak-Post-hoc-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in den unabhängigen Variablen Durchmesser ausgewachsener Eizellen, OM-Prozentsatz, Gesamtzahl der Eier pro Weibchen und Fruchtbarkeit zwischen den drei Laichbehandlungen getrennt zu untersuchen. Die Varianzen zwischen den Gruppen waren bei den GSI-Daten nicht gleich, die logarithmisch transformiert und die Gruppen mithilfe des Brown-Forsythe-Tests und des Games-Howell-Post-hoc-Mehrfachvergleichstests verglichen wurden. Die Laichdaten von rLh + rLh- und rLh + P4-Laichbehandlungen (dh Latenzzeit, Befruchtungs- und Schlupfprozentsätze) wurden mithilfe eines Student-T-Tests verglichen. Unterschiede im Prozentsatz des OM und des Eizellendurchmessers vor und nach den Priming- oder Auflösungsinjektionen sowie der prozentuale Eisprung der in vitro inkubierten Eizellen wurden durch einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen (RM) mit einzelnen Frauen als Probanden untersucht. Für den Vergleich von E2 und 11-KT zwischen Wochen und Behandlungsgruppen wurde eine zweifache RM-ANOVA mit paarweisem Vergleich durch den Holm-Sidak-Test verwendet. Die Parameter der Spermienqualität wurden mit einer einfaktoriellen und zweifaktoriellen RM-ANOVA verglichen. In der einfaktoriellen RM-ANOVA war der Mann das Subjekt, der Tag der Lagerung die unabhängige Variable und die Spermienqualitätsparameter die abhängigen Variablen. In der Zwei-Wege-RM-ANOVA war der Mann das Subjekt, die Lagerungszeit (0 oder 48 Stunden) und die Probenverdünnung (unverdünnt oder Marine Freeze®) waren die unabhängigen Variablen und die Spermienqualitätsparameter die abhängigen Variablen. Signifikante Unterschiede wurden bei einem Signifikanzniveau von P < 0,05 festgestellt. Statistische Analysen wurden mit SigmaPlot Version 12.0 (Systat Software Inc., Richmond, CA, USA) durchgeführt, mit Ausnahme des Brown-Forsythe-Tests, der mit SPSS-Software Version 20.0 (Armonk, NY: IBM Corp) durchgeführt wurde.

Die Induktion und Vervollständigung der Vitellogenese (603 ± 8 µm) bei prävitellogenen und frühen vitellogenen Weibchen wurde in der mit rGth behandelten Gruppe mit 100 % Erfolg erreicht; wie bei allen 12 prävitellogenen Weibchen und allen 9 frühen vitellogenen Weibchen beobachtet. Keine Weibchen aus der Kontrollgruppe schlossen das Eizellenwachstum ab (Abb. 4a).

Mittlerer Eizellendurchmesser der größten Eizellen (n = 20 pro Weibchen) in Nasspräparaten in: (a) jedem Weibchen (dargestellt durch eine Linie), das die rGth-Behandlung erhielt (n = 21) und Weibchen, die Kochsalzlösungsinjektionen erhielten (Kontrolle) ( n = 9). Dreiecke zeigen den Zeitpunkt und die Anzahl der Weibchen, die das vitellogene Wachstum abgeschlossen haben und für die Reifung und Ovulationsinduktion ausgewählt wurden, (b) den mittleren Durchmesser der Eizellen der mit rGth behandelten Weibchen, ausgerichtet ab dem Abschluss des vitellogenen Wachstums, dem Zeitpunkt, der für die Reifung ausgewählt wurde und Laichinduktion. Das Wachstum der Eizellen wird durch eine polynomiale (quadratische) Gleichung zweiter Ordnung (R2 = 0,9625) dargestellt.

Zu Beginn des Experiments waren Weibchen in verschiedenen Stadien der Eierstockentwicklung gleichmäßig auf die Kontroll- und Behandlungsgruppe verteilt (χ2 = 0,824; gl = 2; P = 0,662). In den Kontroll- und rGths-Gruppen befanden sich 62 ± 7 % der Weibchen in der Prävitellogenese (davon befanden sich 61 ± 7 % und 23 ± 16 % im Primärwachstum bzw. im Stadium der kortikalen Alveolen) und 38 ± 7 % in der frühen Vitellogenese (Abb. 5a). ,b) ohne signifikanten Unterschied im mittleren Anfangsdurchmesser der größten Eizellen (Kontrolle = 164 ± 82 µm, rGth-behandelt = 172 ± 72 µm). Obwohl einige Weibchen in Woche 0 mit dem vitellogenen Wachstum begonnen hatten, wiesen die Eierstöcke hauptsächlich PG-Eizellen, einige kortikale Alveolen-Eizellen (SGca) mit sehr wenigen Eizellen in der frühen Vitellogenese und etwas Atresie auf (Abb. 5c, d, ergänzende Abb. S1A).

Prozentsatz der Weibchen in verschiedenen Reifestadien der Gonadenentwicklung in der (a) Kontroll- und (b) rGth-behandelten Gruppe und Entwicklung der prozentualen Häufigkeit der Oozyten-Entwicklungsstadien, die in der (c) Kontroll- und (d) rGth-behandelten Gruppe in verschiedenen Wochen beobachtet wurden der Versuchsperiode. Der Reifestatus der Weibchen wurde durch das am weitesten fortgeschrittene Eizellenstadium in den Proben bestimmt. Um den Prozentsatz jedes Eizellenstadiums zu berechnen, wurden insgesamt 50 zufällige Eizellen pro Frau klassifiziert und die Anteile geschätzt. Jeder Balkenabschnitt stellt den durchschnittlichen Prozentsatz an Eizellen pro Stadium von Frauen für jede Woche dar. PG primär wachsende Oozyte, SGca kortikale Alveolenstufe, SGe frühes sekundäres Wachstum, SGl spätes sekundäres Wachstum Oozyte (≥ 400 µm), SGfg ausgewachsene sekundäre Wachstumsoozyten, GVM anfängliche Keimbläschenmigration.

Prävitellogene Weibchen bei PG aus der Kontrollgruppe zeigten während des Experiments keine weitere Entwicklung (Abb. 5a, ergänzende Abb. S1D). Die Anzahl frühvitellogener Weibchen in der Kontrollgruppe nahm während des Experiments ab, gleichzeitig kam es zu einem Anstieg des Auftretens von Follikelatresien (Abb. 5a, c). Darüber hinaus wurden in der Kontrollgruppe zwischen den Wochen keine signifikanten Unterschiede im Eizellendurchmesser beobachtet (Abb. 4a). Andererseits führte die Hormonbehandlung zu einem signifikanten (P < 0,001) Wachstum des Eizellendurchmessers. Die mit rGth behandelte Gruppe zeigte einen signifikanten wöchentlichen Anstieg des Eizellendurchmessers (P < 0,001) (Abb. 4a) und in der vierten Behandlungswoche war bei allen (100 %) Weibchen die Vitellogenese fortgeschritten (Abb. 5b). Zu diesem Zeitpunkt war in den Eierstöcken eine klare Gruppe vitellogener Eizellen am häufigsten anzutreffen (Abb. 5d, ergänzende Abb. S1B). Ab der sechsten Woche schlossen verschiedene Weibchen das Eizellenwachstum ab (ergänzende Abbildung S1C), wobei die Mehrheit die Gonadenentwicklung in Woche 12 und 13 abschloss. Um das Muster des Eizellenwachstums in der rGth-Gruppe zu definieren, wurden die Eizellen nach Abschluss der Vitellogenbildung ausgerichtet Wachstum und das Wachstum wurde durch eine Polynomgleichung zweiter Ordnung (quadratisch) y = 113,9 + 53,62 x − 1,234 x2 (R2 = 0,9625) dargestellt (Abb. 4b). In früheren Stadien wurde zwischen den Wochen (Injektionen) ein stärkerer Anstieg des Eizellendurchmessers mit etwa 50 µm pro Woche beobachtet, während etwa drei Wochen (Injektionen) erforderlich waren, um die letzten 50 µm zu wachsen und das vitellogene Wachstum abzuschließen. Nach der Berechnung zeigte das Eizellenvolumen (V = 4/3 πr3) dagegen in den späteren Entwicklungsstadien einen größeren wöchentlichen Anstieg (mehr als das Fünffache) im Vergleich zu den frühen Stadien.

Bezüglich der E2-Werte wurden zu Beginn des Experiments keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontroll- und der behandelten Gruppe beobachtet (0,67 ± 0,71 ng mL-1 bzw. 0,68 ± 0,46 ng mL-1), wohingegen ein signifikanter Anstieg (P < 0,001) zu verzeichnen war beobachtet, als die behandelte Gruppe das vitellogene Wachstum abschloss (1,53 ± 0,70 ng mL−1), im Vergleich zu keinen Veränderungen bei den Kontrollen (0,52 ± 0,25 ng mL−1) am Ende des Experiments.

Die Spermiation wurde bei 100 % (n = 9) der Männchen in der mit rGth behandelten Gruppe induziert. Alle Männchen stiegen von einem Spermienindex von 0 oder 1 zu Beginn des Experiments, was darauf hinweist, dass keine Spermienprobe entnommen werden konnte, auf einen Spermienindex von 2 oder 3, was bedeutet, dass die Männchen fließende oder sehr flüssige Spermien hatten. Alle männlichen Kontrolltiere hatten am Ende des Experiments einen Spermienindex von 0, d. h. es waren keine Spermien vorhanden.

Zu Beginn des Experiments waren Männer mit oder ohne Spermien gleichmäßig auf die Kontroll- und Behandlungsgruppe verteilt (χ2 = 0,156; gl = 1; P = 0,693). Nur 20 % (3 von 15 Personen; 1 aus der Kontrollgruppe und 2 aus der rGths-Gruppe) zeigten Spuren von hochviskosem Milz, aber nicht ausreichend, um eine Probe zu erhalten (Abb. 6). Die histologische Untersuchung der Hoden von zwei Fischen, bei denen nach dem Bauchdruck zu Beginn des Experiments keine Milch gewonnen wurde, zeigte, dass ein Männchen nur SPG in den Samenkanälchen aufwies, während das andere Männchen viel SPG und etwas SPC, SPD usw. aufwies SPZ, aber in vielen Tubuli war das zentrale Lumen nicht gebildet, und diejenigen, in denen dies der Fall war, präsentierten nur sehr wenige Spermien (ergänzende Abbildung S2A, B). Während des Versuchszeitraums produzierten die Männchen in der Kontrollgruppe keine fließende Milch, und nur einer von sechs Männchen (17 %) produzierte innerhalb verschiedener Wochen einen kleinen Tropfen zähflüssiger Milch. Am Ende des Experiments enthielten die Hoden von zwei Kontrollmännchen – dem Männchen, das in den vergangenen Wochen zähflüssigen Milchsaft präsentierte, und einem Mann, der nie Milchmilch hatte – Röhrchen mit einer höheren Anzahl an SPC als in der Ausgangssituation, aber es waren keine SPCs vorhanden SPD oder SPZ (Ergänzende Abbildung S2C,D). Im Gegensatz dazu wurden in der rGth-Gruppe laufende Männchen mit fließender weißer Milch beobachtet. Nach fünfwöchiger Behandlung (3 Wochen rFsh-Behandlung und 2 Wochen kombinierte rFsh- und rLh-Behandlung) zeigten acht von neun (89 %) Männern Milch; entweder viskose Spuren (33 %) oder flüssiger Milz (56 %) (Abb. 6). Mit der Anwendung von rLh stieg die Anzahl der Männchen mit fließender Milch. Nach 7 Wochen spermiten 100 % der Männchen mit flüssiger Milch und die Männchen behielten die flüssige Milch bis zum Ende des Experiments (Woche 12) bei, mit Ausnahme von Woche 9, als ein Männchen zähflüssige Milch produzierte. Nach der Anwendung von rFsh in Gruppe 1 und der Fortsetzung der rLh-Behandlung in Gruppe 2 wurde jedoch in der folgenden Woche wieder flüssige Milch produziert. Im deutlichen Gegensatz zu den Kontrollmännern waren in der Histologie von zwei mit rGth behandelten Männern am Ende des Experiments die Spermiengänge der rGth-Gruppe vollständig mit Spermatozoen gefüllt (ergänzende Abbildung S2E, F) und das Spermienvolumen lag im Bereich von 0,25 auf 2,89 ml. Darüber hinaus spiegelten die GSI-Werte das Wachstum des Hodens wider, wobei mit rGths behandelte Männer am Ende des Experiments einen signifikant höheren (P = 0,026) GSI im Vergleich zur Kontrollgruppe aufwiesen. Männer vor der Hormonbehandlung (n = 2) und Kontrollmänner am Ende der Behandlung (n = 2) zeigten dünne, unentwickelte Hoden mit einem GSI von 0,10 ± 0,05 % bzw. 0,06 ± 0,01 %, während mit rGth behandelte Männer am Am Ende des Experiments (n = 2) zeigten sich gut entwickelte weiße Hoden mit einem GSI von 5,35 ± 1,25 %. Zusammengenommen hatten Männer mit einem Spermienindex von 0 und 1 Keimzellen überwiegend in den Stadien SPG und SPC in unentwickelten Hoden (GSI ≲ 0,1), und die rGth-Behandlungen induzierten ein Hodenwachstum (GSI 5,35 ± 1,25 %) und eine Entwicklung von Keimzellen bis zur vollständigen Spermatogenese und liefern Hoden voller Spermien und eine reibungslose Spermiation (Index 2 und 3).

Prozentsatz der nicht spermiierenden und unterschiedlich stark ausgeprägten spermiierenden Männchen in (a) Kontrollgruppe (n = 6) und (b) rGth-behandelter Gruppe (n = 9) während des Behandlungszeitraums der Männchen. Die Männchen wurden in die Kategorien „kein Milz“ (Index 0), „Spuren von zähflüssigem Milz, von dem keine Probe entnommen werden konnte (Index 1), „fließender weißer Milz“ (Index 2) und „sehr flüssiger weißer Milz“ (Index 3) eingeteilt. Daten aus Gruppe 1 (n = 4 mit rGth behandelte Männer, n = 3 Kontrolle) von der ersten Anwendung (Woche 0) bis zur letzten Kontrolle (Woche 12) wurden mit Daten aus Gruppe 2 (n = 5 mit rGth behandelte Männer, n = 3 Kontrolle) von Woche 0 bis 10, um die Ergebnisse zu präsentieren.

In Bezug auf Steroidveränderungen hatte die rGths-Behandlung einen signifikanten Effekt auf den Anstieg der 11-KT-Spiegel (P <0, 001) im Vergleich zur Kontrollgruppe (ergänzende Abbildung S3), die ohne signifikante Änderungen aufrechterhalten wurde. In der rGth-Gruppe wurden im Verlauf des Experiments steigende 11-KT-Werte erhalten, die mit der Verfügbarkeit spermiierender Männchen zusammenfielen, mit dem Maximum nach 8 Wochen und einem Rückgang danach.

Was die Spermienqualität betrifft, so wies das 1:10 in Marine Freeze verdünnte Sperma am Tag der Entnahme (0 Stunden) die folgenden mittleren Eigenschaften auf: Motilität von 58 ± 22 %, Kopfgröße von 13 ± 5 µm2, 107 ± 24 µm s− 1 VCL, 92 ± 29 µm s−1 VAP, 70 ± 31 µm s−1 VSL, 67 ± 12 % STR, 57 ± 16 % LIN und 79 ± 11 % WOB. Während 20 ± 16 % der beweglichen Spermien schnell progredient waren, hatten sie eine Geschwindigkeit von 149 ± 17 µm s−1 VCL, 140 ± 20 µm s−1 VAP, 129 ± 21 µm s−1 VSL, 92 ± 2 % STR, 86 ± 7 % LIN und 93 ± 6 % WOB. Die Unterschiede zwischen den neun Männern waren groß, wobei die prozentuale Spermienmotilität zwischen 19 und 89 % lag. Die mittlere Konzentration betrug 7,59 × 1010 Spermien ml–1 bzw. 15,56 × 1010 Spermien kg–1. Das in Marine Freeze® verdünnte Sperma hatte am Tag der Entnahme (0 Stunden) und 48 Stunden nach der Entnahme eine deutlich höhere Motilität als unverdünntes Sperma (ergänzende Abbildung S4). Die Motilität unverdünnter Spermien nahm vom Tag 0 bis 48 Stunden nach der Entnahme deutlich ab, verglichen mit verdünnten Spermien, die eine ähnliche Motilität aufrechterhielten. Die am Ende des Experiments (Woche 13) gesammelten und in Marine Freeze® verdünnten Spermien behielten über 6 Tage Lagerung bei 4 °C (getestete Tage 0, 1, 2, 4 und 6) eine ähnliche Beweglichkeit mit einer Abweichung von 41,1 ± 20,0 auf 70,2 ± 17,3 %, bevor sie von Tag 4 (70,2 ± 17,3 %) bis Tag 8 (11,7 ± 5,1 %) deutlich abnahm, während Tag 6 mittelmäßig war (41,1 ± 20,0 %).

Weibchen von Flachkopf-Meeräschen, die das vitellogene Wachstum abgeschlossen hatten – verfügbar nur in der rGth-Gruppe – wurden nach drei verschiedenen Behandlungen für die Laichinduktion ausgewählt. Gonadenproben wurden vor den Priming-Injektionen und nach 24:05 ± 0:40 h, unmittelbar vor den auflösenden Dosen, untersucht. Eierstöcke ausgewählter Weibchen wurden von SGfg mit einer mittleren Größe von 603 ± 8 µm zusammengesetzt und die 76 % (16 von 21) der Weibchen wiesen 17 ± 23 % Eizellen auf, die bereits eine OM mit der Migration der Keimbläschen ausgelöst hatten (Abb. 5d); Der Kern hatte sich außermittig bewegt und es kam zu einem geringen Grad an Verschmelzung von Dotterkörnern und Lipidtröpfchen, jedoch ohne eine einzelne große Dottermasse. Es wurden keine signifikanten Unterschiede im Oozytendurchmesser oder im OM-Prozentsatz zwischen den Weibchen festgestellt, die unterschiedliche Laichbehandlungen erhielten. Nach den Priming-Injektionen (24 Stunden) waren 100 % der Weibchen, die rLh erhielten, mit den meisten Eizellen (96 ± 9 %) im späten GVM mit Dotterkoaleszenz in OM eingetreten (ergänzende Abbildung S5). Unterdessen zeigten diejenigen, die P4 erhielten, keinen signifikanten Anstieg des GVM-Prozentsatzes (35 ± 35 %) im Vergleich zum Anfangsstadium (12 ± 5 %), was zeigt, dass die meisten Eizellen im sekundären Wachstumsstadium zurückgehalten wurden.

Der Anteil der Weibchen, die ovulierten oder laichten, variierte nicht zwischen dem anfänglichen Reifestatus der Weibchen zu Beginn des Experiments (χ2 = 1,150; gl = 2; P = 0,563 0,001; χ2 = 2,149; gl = 2; P = 0,342). . In der rLh + P4-Gruppe hatten 100 % der Weibchen 16:36 ± 1:56 nach der Auflösungsinjektion einen Eisprung und acht von neun Weibchen (89 %) laichten im Tank. In der rLh + rLh-Gruppe ovulierten und laichten 100 % der Weibchen (n = 6) 16:51 ± 2:22 h nach der auflösenden Injektion. Unterdessen hatten drei von sechs Fischen (50 %) unter P4 + P4-Behandlung einen Eisprung, aber nur einer (17 %) setzte 24:30 Stunden nach der Verabreichung der auflösenden Dosis tatsächlich einige Eier (177.667 Eier) frei. Die durchschnittliche Anzahl gelaichter Eier und die weibliche Fruchtbarkeit waren bei jeder Hormonbehandlung ähnlich (Tabelle 1). Die Weibchen, die in der P4 + P4-Behandlungsgruppe keinen Eisprung hatten, zeigten nach dem zweiten P4 keinen signifikanten Anstieg der OM (ergänzende Abbildung S5). Die Eier der Weibchen, die den Eisprung hatten und nicht lachten, wurden durch sanften Bauchdruck entfernt, um alle ovulierten Eier vom Weibchen zu befreien. Die ausgezogenen Eier sahen nicht wie lebensfähige Eier aus und bildeten eine dichte, kugelige Masse mit fast keiner Eierstockflüssigkeit.

Die In-vitro-Inkubation von Eizellen, die OM ausgelöst hatten, bestätigte den Eisprung und das Laichen in vivo. Die höchsten Ovulationsprozentsätze (> 50 %) wurden aus Eizellen erhalten, die mit P4 (4000, 1000, 500 und 50 ng ml) oder 100 ng ml rLh behandelt wurden (ergänzende Abbildung S6). Alle mit P4 behandelten Eizellen und Eizellen, die mit 400, 200 und 100 ng mL-1 rLh behandelt wurden, hatten signifikant (P < 0,05) höhere Prozentsätze (> 34 %) der Ovulation als unbehandelte Eizellen (Kontrolle) und Eizellen, die mit rFsh oder 10 ng behandelt wurden ml−1 von rLh (< 8 %). Mit 50 ng mL-1 rLh behandelte Eizellen hatten einen Ovulationsprozentsatz (21,3 ± 18,5 %), der zwischen der höchsten und der niedrigsten Ovulationsgruppe lag.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den Parametern Latenz, Eiproduktion und Qualität festgestellt; Fruchtbarkeit, Prozentsatz der Befruchtung, Überleben oder Schlüpfen des Embryos bei den Weibchen, die rLh als Grunddosis und entweder rLh oder P4 als Auflösungsinjektionen erhielten (Tabelle 1). Es gab auch keine Unterschiede zwischen Weibchen, die sich zu Beginn des Experiments in einem unterschiedlichen Reifestadium befanden. Die mittlere Gesamtfruchtbarkeit betrug 1.738.798 ± 868.950 Eier pro Weibchen (die relative Fruchtbarkeit betrug 1.245.600 ± 552.117 Eier pro kg Körpergewicht) mit einer Befruchtung von 54 ± 21 %. Im Gegensatz dazu wurden die gelaichten Eier eines Weibchens, das P4 + P4 erhielt, nicht befruchtet (0 % Befruchtung).

Es wurden keine Unterschiede in der Ei- und Larvenqualität zwischen den Gruppen rLh + rLh und rLh + P4 beobachtet. Die Überlebens- und Schlüpfraten der Embryonen betrugen 64 ± 22 % bzw. 57 ± 24 %. Die Schlüpfrate in EIA-96-Well-Platten betrug 96 ± 3 %. Eier mit einem Embryo hatten einen Durchmesser von 0,83 ± 0,02 mm (Abb. 7a) und die Larvenlänge beim Schlüpfen betrug 1,86 ± 0,14 mm Gesamtlänge (TL). Die Überlebensrate der Larven in den 96-Well-Platten bei 21 °C betrug 85 ± 18 % bei 2 DHP, 67 ± 18 % bei 5 DPH, 55 ± 17 % bei 9 DPH und sank bis auf 8 ± 11 % bei 12 DPH. Bei 14 dph waren alle Larven tot.

Embryonen, Larven, postlarvale und juvenile Stadien von Mugil cephalus. (a) Embryo mit geformtem Kopfbereich und dunklem Pigment, das fast den gesamten Körper und die Ölkügelchen (OG) bedeckt, (b) frisch geschlüpfte Larven, (c) Larven bei 2 Tagen pro Stunde mit bereits pigmentierten Augen, (d) Larven bei 3 Tagen pro Stunde mit vollständig geformten und funktionsfähigen Mundteilen, (e) Larven bei 9 dph mit noch vorhandenem Ölkügelchen, (f) Larven bei 19 dph mit vollständig absorbiertem Ölkügelchen und (g) mit einer hyperaufgeblasenen Schwimmblase (SB), ( h) Nachlarven bei 32 Tagen pro Stunde, (i) Nachlarven bei 37 Tagen pro Stunde, (j) Jungtiere bei 39 Tagen pro Stunde. Maßstabsbalken: 500 μm in (a–g), 1 mm in (h–j).

Die für den vorläufigen Larvenkulturversuch verwendeten Larven wiesen beim Schlüpfen eine TL von 2,1 ± 0,05 mm auf und zeigten eine homogene Dottermasse mit einem runden Öltröpfchen im hinteren Teil des Dottersacks (Abb. 7b). Die Augen begannen zwischen dem 1. und 2. Tag pro Stunde zu pigmentieren. Ober- und Unterkiefer waren gut entwickelt und das Maul war ab 3 dph (2,93 ± 0,08 mm TL, Abb. 7c, ergänzende Abb. S7) geöffnet, als die Larven den größten Teil der Dotterreserven verbraucht hatten und nur noch die Ölkügelchen übrig blieben (Abb . 7d). Die Phase vor der Beugung dauerte 4 bis 19 Tage pro Stunde, wobei Eigelb und Öltröpfchen vollständig absorbiert waren (11 Tage pro Stunde). Die Bildung der Schwimmblase begann etwa am 4.–6. Tag (2,9–3,11 mm TL, ergänzende Abb. S7) und war ventral unterhalb des Notochords sichtbar. Die Schwimmaktivität der Larven nahm während der Bildung und Vergrößerung der Schwimmblase zu, obwohl einige Larven aufgrund einer Überblähung der Schwimmblase entweder am Boden des Beckens schwammen oder auf der Wasseroberfläche schwammen, ohne sich zu bewegen und/oder sich von Rädertierchen zu ernähren Blase (Abb. 7g). Die meisten dieser Larven starben und um diese Sterblichkeit zu reduzieren, wurde die Lichtintensität von 9 dph bis zum Ende des Aufzuchtversuchs auf 500 lx reduziert. Die Schwanzflexion war abgeschlossen, als die Larven eine Länge von 3,7 mm erreichten, während das Postflexionsstadium mehrere Tage lang verlängert wurde (20–30 dph, 4,3–5,3 mm TL, ergänzende Abb. S7), bis die Schwanzflosse und die Gabel fertiggestellt waren. Am Ende des Versuchs (Tag 39) sahen alle Fische wie erwachsene Tiere aus und galten als Jungfische (Abb. 7j). Die Entwicklung von Mugil cephalus-Larven und postlarven Stadien bis hin zu Jungtieren ist in Abb. 7 und der ergänzenden Abb. S7 dargestellt.

Bei der Flachkopf-Meeräsche (Mugil cephalus), die unter intensiven Bedingungen in Gefangenschaft gehalten wurde, kam es zu Beginn des Reifungsprozesses zu Fortpflanzungsstörungen, und sowohl Männchen als auch Weibchen benötigten Unterstützung, um die Vitellogenese, die Reifung der Eizellen und den Eisprung zu induzieren sowie die Spermatogenese, Spermiation und das Laichen zu fördern. Die vorliegende Studie zeigt, dass rFsh und rLh als zuverlässige Methode verwendet werden können, um die Oogenese aus der Prävitellogenese zu induzieren und zu vervollständigen, Milch zu produzieren und spontanes freiwilliges Laichen im Becken zu induzieren, und zwar bei 100 % der Versuchsfische, um lebensfähige Eier und Larven von guter Qualität zu liefern.

Bei der Beobachtung des Entwicklungsstadiums der Eierstöcke zu Beginn des Experiments wurden bei Frauen eine Reihe von Funktionsstörungen festgestellt; Fische wurden in Stadien gefangen, die von der Prävitellogenese wie bei Ramos-Júdez et al.9 bis zur frühen Vitellogenese wie in anderen Mittelmeergebieten berichteten15 reichten. Dennoch wiesen in der vorliegenden Studie die Eierstöcke der frühen vitellogenen Weibchen zu Beginn des Experiments nur wenige vitellogene Eizellen auf, die nicht homogen verteilt waren, und tatsächlich waren prävitellogene Eizellen bei allen Weibchen das häufigste Entwicklungsstadium. Die Weibchen, die die rFsh- und rLh-Behandlung erhielten, wie zuvor von Ramos-Júdez et al.9 beschrieben, zeigten eine gleichmäßige Ansammlung reichlich vorhandener Eizellen, die für die Vitellogenese rekrutiert wurden, und folgten der typischen Eierstockentwicklung dieser Art. Mugil cephalus weist eine gruppensynchrone Entwicklung der Eierstöcke auf, wobei jedes Jahr nach einer einzelnen Laichepisode ein Gelege Eizellen heranreift24. Die rGth-Hormonverabreichung war zu 100 % erfolgreich bei der Induktion der Vitellogenese von der Prävitellogenese (12 von 12 Frauen) und der frühen Vitellogenese (9 von 9 Frauen) bis hin zum vollständigen vitellogenen Wachstum. Im Vergleich dazu blieben Kontrollweibchen, die sich in einem frühen Stadium der Vitellogenese befanden, während des Experiments ohne Fortschritte in der Gonadenentwicklung und zeigten eine Atresie, was auf eine mangelnde Stimulation der vitellogenen Eizellen zur weiteren Entwicklung hinweisen könnte16. Prävitellogene Kontrollweibchen zeigten keine weitere Entwicklung. Diese Beobachtung steht im klaren Gegensatz zu Aizen et al.15, bei dem bis zu 20 % der Kontrollweibchen ohne hormonelle Stimulation reife Eizellen entwickelten. Der Abschluss der Vitellogenese bei mit rGth behandelten Weibchen ging mit einem Anstieg der Plasma-E2-Spiegel einher, der bei den Kontrollen nicht beobachtet wurde, was auf die gonadotrope Stimulation des Eierstocks durch rGths hinweist. Ramos-Júdez et al.9 erzielten unter Verwendung derselben rGths ein nahezu identisches Ergebnis mit einem Anstieg der Plasma-E2-Spiegel und acht von neun (89 %) der behandelten Frauen, die die Oogenese abschlossen.

Die rGth-Behandlung bei Männern induzierte und verstärkte die Spermatogenese und Spermiation, da 100 % der behandelten Männer 8 Wochen oder länger flüssige Milch produzierten. Im Vergleich dazu hatten die Kontrollmännchen während des Experiments kein fließendes Sperma. Die histologische Untersuchung von Männchen in unterschiedlichen Stadien der Spermiation ergab, dass Männchen in Gefangenschaft zu Beginn oder in der Kontrollgruppe, die keine Spermien oder einen kleinen Tropfen zähflüssigen Spermiens präsentierten, unentwickelte Hoden mit einem niedrigen GSI (≲ 0,1 %), vorwiegend SPG und SPC und wenigen oder keinen SPDs hatten oder SPZ. Im Vergleich dazu zeigte die histologische Untersuchung, dass mit rGth behandelte Männer gut entwickelte Hoden mit einem signifikant höheren GSI (5,35 ± 1,25 %) hatten, der 50-mal höher war als bei Kontrollmännchen, und dass die Hoden vollständig mit SPZ und ohne SPG oder SPC gefüllt waren. Obwohl es ein signifikantes Wachstum gab, ist möglicherweise etwas Vorsicht bei der Extrapolation der Histologie von zwei Fischen auf die anderen Individuen in der Kontroll- und der rGth-Gruppe geboten. Es standen nur wenige Männchen zur Verfügung und der n-Wert für die Histologie wurde reduziert, um sicherzustellen, dass genügend Männchen für die rGth-Behandlung und das Laichen zur Verfügung standen. Alle Beweise deuten darauf hin, dass die rGths die Spermatogenese einer großen Anzahl von Keimzellen vom frühen Stadium (SPG und SPC) bis zum SPZ induziert haben. Offensichtlich ist mehr Arbeit zur Bestätigung dieser rGth-Wirkung erforderlich und es muss eine spezifische Studie über die direkte Wirkung jedes rGth auf die Hodenentwicklung und auf das Verabreichungsmuster durchgeführt werden, um die Schlussfolgerungen zu konsolidieren. Wie in der vorliegenden Studie jedoch angedeutet, haben andere Studien die Spermatogenese mit rGths erfolgreich induziert, z. B. bei sexuell unreifen europäischen Aalen6, unreifen japanischen Aalen25,26,27 und reifen senegalesischen Seezungen7,8. Peñaranda et al.6 stellt eine spezifische Studie dar, in der verschiedene Kombinationen bei der Anwendung von homologem rFsh und rLh (hergestellt von Rara Avis Biotec, SL wie in der vorliegenden Studie) bei unreifen europäischen Aalen getestet wurden, die zu unterschiedlichen Hodenentwicklungen einschließlich unterschiedlicher Spermiationsgrade führten . Die biologischen Wirkungen von rGths auf Männer wurden auch anhand der Plasmaspiegel von 11-KT bewertet, dem wichtigsten Androgen, das für die Hodenentwicklung verantwortlich ist1,18,28. Die rGth-Behandlung erhöhte die 11-KT-Spiegel im Plasma der behandelten Männer im Vergleich zu den Kontrollmännchen signifikant. Die Plasmakonzentration von 11-KT bei behandelten Männern stieg allmählich als Reaktion auf die Anwendung von rFsh und rLh an, während die Reife mit dem Vorhandensein von Spermien und der erhöhten Fließfähigkeit der Milch, die bei allen behandelten Männern ab der 5. Woche erhalten wurde, fortschritt. Die gemessenen 11-KT-Spiegel von 0,1 bis 28 ng mL-1 lagen im Bereich der Werte, die zuvor bei männlichen Meeräschen mit flachem Kopf gemessen wurden, die mit 17α-Methyltestosteron-Implantaten behandelt wurden, um die Spermatogenese und Spermiation zu verbessern15.

In der vorliegenden Studie wurden höhere Mengen flüssiger Milch erhalten (0,25 bis 2,89 ml) als bei Ramos-Júdez et al.9 (maximal ~ 0,25 ml). Die erhöhte Spermienproduktion kann auf das unterschiedliche Muster und die unterschiedliche Dosierung der rGths-Verabreichung zurückzuführen sein, die einen längeren Zeitraum und höhere Dosen für rLh umfasste. Die Qualität der Spermien war bei den neun mit rGth behandelten Männern unterschiedlich, wobei die mittleren Spermienqualitätsparameter Motilität und Geschwindigkeit angemessen waren. Das gewonnene Spermienvolumen gehörte mit 0,1 bis 2 ml29 zu den höchsten, die für wilde, ausgewachsene Mugil cephalus berichtet wurden, und die Konzentration war zwei Zehnerpotenzen (1010) höher als zuvor berichtet (108)29, was auf einen höheren Verdünnungsgrad während der Spermiation hinweist , was auf die Wirkung von Lh30 zurückgeführt wird, wäre wünschenswert. Das Streckmittel Marine Freeze® war wirksam, um die Spermienqualität während einer sechstägigen Lagerung bei 4 °C aufrechtzuerhalten, was ebenfalls darauf hinwies, dass die Spermien von guter Qualität waren.

Aus angewandter Sicht war die Entwicklung des Männchens mit dem Abschluss der Vitellogenese des Weibchens synchronisiert, wodurch es für das Laichen verfügbar war. Ausgewählte Männer hatten flüssige Spermien und erhielten entweder 12 oder 24 µg kg−1 rLh, um die Spermiation und das Fortpflanzungsverhalten zu stimulieren. Bei den Weibchen wurden drei Behandlungen angewendet, um die Reifung der Eizellen, den Eisprung und das Laichen zu induzieren. Die Anwendung von 30 µg kg−1 rLh als Priming-Injektion induzierte bei allen 100 % der Weibchen die Reifung der Eizellen mit der Migration der Keimbläschen, wenn sie vor der Anwendung der auflösenden Dosis (24 Stunden nach der Priming-Dosis) überprüft wurde. Die folgenden auflösenden Injektionen von 40 mg kg-1 P4 oder 30 µg kg-1 rLh lösten bei 100 % der Fische einen Eisprung und bei 89 % (P4-Auflösung) bzw. 100 % (rLh-Auflösung) der Fische das Laichen im Becken aus, mit einem Mittelwert Eine prozentuale Befruchtung von 54 ± 21 % zeigt den Erfolg bei der Anwendung beider Behandlungen. Der In-vivo-Erfolg der auflösenden Dosen wurde durch den Erfolg sowohl von P4 als auch von rLh bei der Auslösung der In-vitro-Ovulation nach der Priming-Dosis von rLh bestätigt. Der In-vitro-Test zeigte, wie wichtig die Auswahl einer korrekten rLh-Dosis für die Auslösung des Eisprungs ist, da die Reaktion der Eizellen je nach rLh-Konzentration im Medium unterschiedlich ausfiel. Ansonsten waren niedrige P4-Dosen für die Auslösung des Eisprungs genauso wirksam wie hohe Dosen, was darauf hindeutet, dass eine Verfeinerung der in vivo angewendeten P4-Dosis möglich wäre. Im Gegensatz zu Frauen, die rLh als Priming-Injektion erhielten, hatten Frauen, die Priming P4 erhielten, 24 Stunden nach der Priming-Dosis keine OM eingeleitet. Die auflösende P4-Dosis hatte bei 50 % der Weibchen keine Wirkung, während die anderen 50 % der Weibchen einen Eisprung hatten und nur ein Weibchen (17 %) Eier hervorbrachte, die nicht befruchtet wurden. Obwohl P4 als vorbereitende und auflösende Behandlung den Eisprung auslöste, konzentrierte sich der gesamte Reifungs- und Ovulationsprozess auf weniger als 24 Stunden nach Anwendung der auflösenden Dosis. Im Vergleich dazu beendeten Weibchen, die rLh als Grundierung erhielten, die OM und den Eisprung innerhalb von 40:45 ± 2 Stunden, indem sie die OM nach der Grunddosis einleiteten und die OM, den Eisprung und das Laichen nach der Auflösungsdosis abschlossen. Es ist möglich, dass der Eisprung durch das doppelte P4 induziert wurde, obwohl OM nicht ordnungsgemäß induziert wurde, was auf die Bedeutung von Lh oder Lh-induzierten Faktoren in diesem Prozess hinweist, wie bereits von Ramos-Júdez et al.9 angegeben. In dieser Studie entwickelten sich nur die Weibchen, die die höchste rLh-Priming-Dosis (30 μg kg-1) erhielten, zu OM, im Vergleich zu Weibchen, die eine niedrigere rLh-Priming-Dosis (15 μg kg-1) erhielten, die sich nicht zu OM entwickelte. Zusammengenommen scheint die Wirkung der Hormone die beschriebenen Rollen zu bestätigen1,16, da hohe rLh-Dosen erforderlich waren, um die Reifung der Eizellen zu induzieren, und entweder rLh oder P4 nach der vorbereitenden rLh-Dosis benötigt wurden, um den Eisprung und das Laichen auszulösen.

Die beiden Hormonbehandlungen rLh + rLh und rLh + P4 führten zum spontanen Laichen einer großen Anzahl befruchteter Eier im Becken. Daher induzierte die rGth-Behandlung nicht nur die Gametogenese, sondern auch das Fortpflanzungsverhalten beider Geschlechter, um eine erfolgreiche Balz zu erreichen, die zum Laichen und zur erfolgreichen Befruchtung freigesetzter Gameten führte. Das Vorhandensein hochwertiger Männchen mit fließender Milch im Becken könnte ebenfalls ein entscheidender Faktor für den Laicherfolg gewesen sein. Außerdem könnte auch ein angemessenes Verhältnis zwischen Männern und Frauen wichtig gewesen sein. In der vorliegenden Studie wurden Männchen-zu-Weibchen-Verhältnisse von 2:1 oder 3:1 zusammengestellt, und die Männchen beobachteten typisches Paarungsverhalten – dicht an das Weibchen heranschwimmen, den Hinterleib mit Kopf und Körper drücken und kurzzeitig mit dem Schwimmen aufhören12 Weibchen hatten geschwollene Bäuche. Darüber hinaus deuten die Daten aus der vorliegenden Studie darauf hin, dass durch die Induktion der Oogenese durch rFsh und rLh bei prävitellogenen Weibchen qualitativ hochwertige Eier mit einer Befruchtung von bis zu 80 % erhalten werden können. Die Gewinnung qualitativ hochwertiger schwimmender Eier von Weibchen, die mit behandelten Männchen laichen, steht im deutlichen Gegensatz zu dem Bericht von Ramos-Júdez et al.9, in dem nach dem Priming von rLh und der Lösung der P4-Laichbehandlung kein spontanes Laichen beobachtet wurde. Ramos-Júdez et al.9 beobachteten kein Laichverhalten bei mit rGth behandelten Fischen und daher wurden die Gameten entfernt und künstlich befruchtet, um eine prozentuale Befruchtung von 0,4 % zu erreichen. Daher lässt die vorliegende Studie vermuten, dass andere Faktoren wie eine Verzögerung beim Entnehmen der Eier, die mit dem Prozess der Überreifung der Eier zusammenfällt, wie in Ramos-Júdez et al.9 angegeben, zu den niedrigen Befruchtungsprozentsätzen in dieser Studie geführt haben könnten die Anwendung der rGth-Behandlung an sich.

Vergleiche des Laicherfolgs (Anzahl der Fische, die von der Gesamtzahl der injizierten Fische laichen), der Befruchtungsraten und der Fruchtbarkeit in anderen Studien mit Flachkopf-Meeräschen sind aufgrund von Unterschieden in der Methodik und im anfänglichen Gonadenentwicklungsstadium der Individuen begrenzt. In einigen Studien wurde versucht, die Vitellogenese zu verbessern, beispielsweise durch die Verabreichung von 5 mg kg-1 Domperidon (Dom) oder in Kombination mit Implantaten von 10 µg kg-1 Gonadotropin-Releasing-Hormon-Agonisten (GnRHa), bei denen die Rate vollreifer Frauen geringer war wurden erhalten (50–85 %)15. Viele andere Studien befassten sich direkt mit dem Fang voll ausgewachsener Weibchen und verwendeten unterschiedliche Behandlungen, um die Reifung und das Laichen der Eizellen zu induzieren. Beispielsweise verwendeten Aizen et al.15 GnRHa (10 µg kg-1 Grundierung, 20 µg kg-1 Auflösung) in Kombination mit Metoclopramid (15 mg kg-1 Grundierung und Auflösung), El-Gharabawy und Assem31 injizierten 20 bis 70 mg kg −1 Karpfen-Hypophysenextrakt oder 10.000 IU Fisch −1 hCG als Grundierung und eine oder zwei auflösende Injektionen von 100–200 µg kg−1 GnRHa, Besbes et al.32, behandelt mit einer Grunddosis von 10.000 IU kg−1 hCG und Auflösung von 10.000 IE kg-1 hCG und 200 µg kg-1 GnRHa, während Vallainc et al.33 200 µg kg-1 GnRHa injizierten. Diese Behandlungen führten jeweils zu: (i) 85 % Laicherfolg mit niedrigen (< 40 %) bis hohen (< 90 %) Befruchtungsraten und Fruchtbarkeiten von 1.649.000 Eiern pro Kilogramm Körpergewicht, (ii) 40 % Laicherfolg mit 75 bis 80 % Befruchtung und Fruchtbarkeit von 1.395.000 Eiern kg-1 KG, (iii) 100 % Erfolg mit 63 % Befruchtung, aber geringe Fruchtbarkeit von 418.945 Eiern kg-1 KG und (iv) 58 % bis 100 % Erfolg mit 83 ± 14 % Befruchtung und Fruchtbarkeit von 799.000 ± 109 Eiern kg−1 KG. Im Allgemeinen zeigten diese Studien einen sehr unterschiedlichen Laicherfolg und/oder unterschiedliche Befruchtungsprozentsätze, während die vorliegende Studie einen zuverlässigen Laicherfolg von 85 bis 100 % je nach Laichbehandlung mit einer der höchsten Fruchtbarkeiten von 1.245.600 ± 552.117 Eiern pro kg zeigt −1 KG, erhalten von Weibchen, die die Prävitellogenese erfolgreich induziert haben.

Was die Eiqualität befruchteter Eier betrifft, die in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert wurden, so entwickelten 96 ± 3 % der befruchteten Eier Embryonen und schlüpften, was auf eine hohe Eiqualität hinweist. Darüber hinaus überlebten die Larven bis zu 13 Tage bei 21 °C ohne exogene Fütterung, was als große Verbesserung im Vergleich zur vorherigen Studie von Ramos-Júdez et al.9 gilt, in der die Larven bei 24 °C nicht länger als 4 dph überlebten. Nicht nur Larven überlebten länger ohne externe Fütterung, sondern auch Larven, die unter Mesokosmenbedingungen aufgezogen wurden, zeigten das Potenzial, sich bis zu Jungtieren zu entwickeln, was darauf hindeutet, dass Eier und Larven, die nach der Induktion der Gametogenese mit rFsh und rLh gewonnen wurden, eine Brutstätte versorgen könnten. Tatsächlich war die Entwicklung und das Wachstum der Larven in unserer Studie unter Mesokosmen-Aufzuchtbedingungen sehr ähnlich zu anderen veröffentlichten Studien, die entweder intensive oder ausgedehnte Bedingungen verwendeten31,32,34,35. Die meisten dieser Studien betonten die Wirkung der Algenzugabe zu den Aufzuchtbecken (Grünwassertechnik) als beste Möglichkeit, die Larvenfütterung an Rädertierchen zu optimieren, da sie nicht nur den Kontrast erleichtert, sondern auch den Ernährungszustand und/oder die Gesundheit verbessert der Rädertiere36. Das Größenwachstum der Larven war ähnlich wie in anderen Studien32,33, wobei die Larven beim Schlüpfen eine TL von 2,1 mm und bei 4 dph eine TL von 2,96 mm maßen, gefolgt von einem stagnierenden Wachstum zwischen 4 und 11 dph, als die Larven eine TL von 3,5 mm erreichten. Das Wachstum beschleunigte sich von 13 auf 35 dph, als sie 5 mm TL erreichten, und dann bis zum 39. Tag, als sie fast 7 mm TL erreichten. Das in der vorliegenden Studie verzeichnete exponentielle Wachstum ähnelte dem von Besbes et al.32 beschriebenen. Daher war es vielversprechend, dass die in den Mesokosmen aufgezogenen Larven ein ähnliches Wachstum und eine ähnliche Entwicklung zeigten wie andere Studien an Meeräschenlarven mit flachem Kopf, was auf das Potenzial für die Brutproduktion von Larven aus Erwachsenen hinweist, deren Gametogenese mit rGths induziert wurde.

Während der Larvenaufzucht der Flachkopf-Meeräsche wurden zwei kritische Perioden beschrieben37: eine an den Tagen 2–3 nach dem Schlüpfen aufgrund der Resorption des Dottersacks, einer Abnahme der Lipidreserven und einer Zunahme des spezifischen Gewichts der Larven, die auf den Boden sinken zum anderen bei 8–11 dph während der Schwimmblasenbildung mit übermäßigem Aufblasen, insbesondere in intensiven („künstlichen“) Aufzuchtsystemen (Nash et al.39; Nash und Kuo,40). Diese Zeiträume würden die höheren Mortalitäten von 85 ± 18 % Überleben bei 2 dph bis 55 ± 17 % bei 9 dph und 8 ± 11 % bei 12 dph rechtfertigen, die bei Larven beobachtet wurden, die in 96-Well-Platten ohne exogene Fütterung gehalten wurden. Obwohl das Überleben nicht das Ziel der Larvenaufzucht in Mesokosmen war, war das Hauptsterblichkeitsproblem die Überblähung der Schwimmblase. Die betroffenen Larven blieben an der Wasseroberfläche schwimmen, ohne sich zu bewegen und/oder sich von Rädertierchen zu ernähren. Diese übermäßige Inflation wurde bei anderen Meeresfischlarven beobachtet, beispielsweise bei Larven von mageren Fischen (Argyrosomus regius)41, und ist häufig mit Stressbedingungen wie hoher Lichtintensität, der Verwendung einer langen Photoperiode, einer zu frühen Einführung von Beute während der Larvenaufzucht usw. verbunden hohe Larvendichte42,43,44, die dazu führt, dass die Larven zu viel Luft an der Wasseroberfläche schlucken, was zu einer Hypertrophie der Schwimmblase führt.

Der in der vorliegenden Studie beschriebene Ansatz zur Induktion der Oogenese von der Prävitellogenese oder frühen Vitellogenese bis zum Abschluss des Oozytenwachstums und des Laichens unter Verwendung einkettiger rekombinanter Gonadotropine (rFsh und rLh), die in CHO-Zellen produziert werden, bietet Reproduzierbarkeit und garantiert einen hohen Erfolg beim Laichen und bei hohen Eizellen Qualität in Flachkopf-Meeräsche. Es war bezeichnend, dass die rGths nicht nur die Reifung von der frühen Gametogenese bis hin zur Produktion lebensfähiger männlicher und weiblicher Gameten induzierten, sondern auch die Prozesse und die Kaskade von Hormonen und Pheromonen induzierten, die das Fortpflanzungsverhalten und die erfolgreiche Paarung sowohl bei Weibchen als auch bei Männchen steuern. Aus angewandter Sicht bietet das vorliegende Protokoll eine vollständige Kontrolle der Reproduktion bei langfristiger wöchentlicher rGth-Verabreichung. Das Protokoll lieferte eine hohe Fruchtbarkeit der Weibchen der Flachkopf-Meeräsche (ca. 1.700.000 weibliche Eier − 1), wobei ca. 50 % der gelaichten Eier befruchtet und ausgebrütet wurden. Diese Fruchtbarkeit deutet darauf hin, dass die Einführung von 6–7 Weibchen (ca. 1 kg) pro Saison eine Brutproduktion von ca. 1 Million Jungfischen ermöglichen könnte, basierend auf den in der Literatur berichteten Überlebensraten. Dies würde den Bedarf vieler Züchter und die Menge der eingesetzten Hormone verringern. Darüber hinaus kann das vorliegende Protokoll wahrscheinlich zur Entwicklung von Laich- und Zuchtprogrammen außerhalb der Saison sowie bei anderen Fischarten, die in der Prävitellogenese gefangen werden, nicht nur für Aquakultur-, sondern auch für Erhaltungszwecke angewendet werden.

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Besonderer Dank gilt Cristian Martínez Rodríguez, Alex Rullo Reverté, Esteban Hernández, Magda Monllaó und Sandra Molas für die Betreuung der Fische und Larven und die technische Hilfe bei den Probenahmen. Vielen Dank auch an Marta Sastre, Edgar Bertomeu und Noelia Gras für die Hilfe bei der Steroidanalyse. Diese Studie wurde von der spanischen Regierung, MINECO, finanziert, Projekt: RTI2018-094710-R-I00.

Sandra Ramos-Júdez

Aktuelle Adresse: S2AQUAcoLAB, Av. Do Parque Natural da Ria Formosa s/n, 8700-194, Olhão, Portugal

IRTA, Sant Carles de la Ràpita, Ctra. von Poble Nou km. 5.5, 43540, Sant Carles de la Ràpita, Tarragona, Spanien

Sandra Ramos-Júdez, Josep Gumbau-Pous, Lucas Stephen Arnold-Cruañes, Alicia Estévez und Neil Duncan

Rara Avis Biotec, SL, Valencia, Spanien

Ignacio Gimenez

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SR-J.: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Vorbereitung des Schreibens-Originalentwurfs, Visualisierung. IG: Konzeptualisierung, Methodik, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten, Supervision. JG-P.: Recherche, Schreiben-Rezensieren und Bearbeiten. LSA-C.: Recherche, Schreiben-Rezensieren und Bearbeiten. AE: Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten, Visualisierung, Finanzierungsakquise. ND: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Datenkuration, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten, Überwachung, Finanzierungseinwerbung, Projektverwaltung.

Korrespondenz mit Sandra Ramos-Júdez, Ignacio Giménez oder Neil Duncan.

Dr. IG ist mit dem Biotech-Unternehmen Rara Avis Biotec, SL verbunden, das die in dieser Studie verwendeten rekombinanten Gonadotropine hergestellt hat. Ansonsten gibt es keine Patente oder Produkte in der Entwicklung, die angemeldet werden könnten. Die übrigen beitragenden Autoren geben an, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ramos-Júdez, S., Giménez, I., Gumbau-Pous, J. et al. Rekombinante Fsh- und Lh-Therapie zur Laichinduktion von prävitellogen und früh spermatogen arretierten Knochenfischen, der Flachkopf-Meeräsche (Mugil cephalus). Sci Rep 12, 6563 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10371-0

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Eingegangen: 30. November 2021

Angenommen: 28. März 2022

Veröffentlicht: 21. April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10371-0

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